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细胞培养中的支原体污染-原因、问题和解决方案

作者:Admin 日期:2020-09-17 点击:120
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细胞培养中的支原体(Mycoplasma)污染会严重影响实验结果的可靠性、可重复性和一致性。它对科研和生物制品生产有着巨大的影响。

支原体污染很难检测到,因此可能存在几个月都无法发现。实际上,所有细胞培养中有超过10%被支原体污染。这表明,通过检测确定培养未被污染非常重要。

现在,我们从如何克服支原体污染的检测、消除和预防几方面给予最佳的解决方案。


什么是支原体?

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支原体是一种特殊的微生物,在哺乳动物(包括人类)、爬行动物、昆虫和植物中广泛分布。它是最小、最简单的可自我复制的原核生物,大小仅为0.2-0.8um。支原体的基因组仅为0.58-2.20Mb,其自身生物合成能力有限,因此大部分营养物质都要依赖于宿主。

支原体污染的来源

         支原体的典型污染途径是:使用同一个培养基,或者使用同一培养基的其他细胞的交叉污染(例如,通过移液过程中产生的气溶胶)。

         其他污染途径可能包括:操作人员的直接污染、使用受污染的材料(如动物血清)。

         培养基的高污染风险凸显了向信誉良好的制造商购买高质量细胞培养基的重要性。

支原体污染对细胞培养的影响

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支原体污染会多方面影响细胞培养,其中大多数会降低实验结果的可靠性、可重复性和一致性。影响的严重程度通常取决于您所使用的细胞类型。在真核细胞中一般可以观察到:

-营养缺乏导致蛋白质、RNADNA合成水平改变

-细胞形态变化

-细胞因子表达增加(或减少)

某些支原体的污染也可能引发细胞病变,其原因可能是促进或抑制了细胞凋亡、发育、异常生长或细胞变形。对于研究及生物产品和生物药物生产期间,这是一个主要的问题,因为污染会导致产量降低或整个产品批次的损失。此外,杂交瘤细胞生产抗体时如果被支原体污染,可表现为抑制细胞融合和降低单抗产量。

如何检测细胞培养物中的支原体污染?

很不幸,快速可靠地检测细胞培养物中的支原体污染非常困难。原因之一是支原体污染通常不会像其他微生物污染一样导致培养物发生明显的浊度变化。此外,支原体太小,无法在不使用特殊标记的情况下用光学显微镜观察。

但由于支原体污染,细胞培养可能会出现一些细微的变化,通过这些现象可以推断出有支原体污染的可能。例如,由于支原体会和细胞竞争培养基中的营养,因此污染首先被观察到的现象就是细胞增殖速率降低。其他变化包括:细胞聚集、形态变化和转染率降低(当使用以前转染率高的细胞时更容易发现)。

确定支原体污染的唯一方法就是检测。现有的检测方法有细胞组化染色、ELISADNA荧光染色、微生物培养、生化法和PCR法。

最好的检测方法应该是具有高灵敏度和特异性的,还需要较短的检测时间。基于以上标准,我们比较一下最常见的检测方法。


使用PCR检测支原体污染

PCR法是扩增样品中特定的DNA序列,是一种灵敏快速的方法,可以识别细胞培养物中的支原体污染。但是,在实际测试过程中存在将污染物从阳性对照(或以前支原体检测阳性的样品)传播到未污染样品的风险,从而导致假阳性结果。而且尽管有许多支原体的PCR检测试剂盒,但并非所有种类支原体都可以被检测到。


培养法检测支原体污染

有下面几种培养方法用于检测支原体污染:

1)肉汤和琼脂培养法

该方法在支原体肉汤培养基中培养样品,再将培养物涂到支原体琼脂平板上,然后确定是否形成支原体菌落。该方法具有高度的特异性和敏感性,但检测时间较长,通常需要21天以上。

2)细胞培养法

该方法使用支原体可高度增殖的特殊细胞,对培养物进行荧光染色,可确定是否污染了支原体。虽然敏感度较高,但只对有限的支原体DNA敏感。

3)生物传感器法

使用经过基因改造的细胞检测支原体。在存在支原体污染时激活特定受体,可观察到细胞明显的颜色变化。这种方法敏感度高,但特异性较低。

通过细胞生产生物制品(如疫苗、单抗和类似产品)需要通过上述方法1)和2)的测试,以确定不存在支原体污染。这些测试中,还需要支原体或受污染的细胞做阳性对照。而阳性对照可能会影响实验室的无菌,因此这些测试通常在专门的实验室进行。


生化法检测支原体污染

         支原体的酶和其他真核细胞有明显区别。这样就可以通过检测细胞培养物中的酶来检测支原体污染。由此设计了MycoAlert PLUS支原体检测试剂盒,其中包含萤光素酶。这种方法的原理是:首先将支原体细胞裂解,释放其中的酶。这些酶与试剂盒中的底物结合,产生ATP。萤光素酶被ATP激活产生光信号,然后用发光计进行检测。这是确定培养物中支原体的快速方法。

使用荧光显微镜检测支原体

也可用非特异性的DNA染料通过荧光显微镜检测支原体DNA。将染料加入培养基中,然后用荧光显微镜观察,通过在细胞间出现的亮点确定支原体DNA的存在。

支原体污染有哪些影响?


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对细胞培养来说,所有污染都有影响。但相比其他细菌和真菌污染来说,支原体污染更难被发现。因为支原体非常小,而且繁殖慢。
细胞培养中的支原体污染会严重影响细胞的表现,使结果不可靠和不可重复。发现支原体污染是令人沮丧的事情,因为您必须重新进行自从污染后的一切实验,但是,如果希望尽可能获得准确的实验数据,最好的方法是重新进行所有实验。
如果重新开始实验,要检查实验流程,包括设备是否安全,如培养箱和水浴。还要查看流程中是否有容易导致支原体污染的地方。

遭遇支原体污染后,怎么处理?

丢弃被污染的培养物是处理支原体污染的最佳选择。但是,如果您的样本具有不可替代性,那么可以尝试消除支原体污染。但是,消除支原体污染的过程可能需要几周,甚至更长。
有许多方法可以消除支原体污染。主要分为四类:化学疗法、化学法、抗生素法和物理法。过程包括:去污剂清洗、添加补体、细胞克隆、热处理和过滤。但是这些方法的可靠性不高,因为他们不能消除所有的支原体。而且它们也非常耗时,消除效率也很低。例如,抗生素在白血病-淋巴瘤细胞系中显示出较好的结果。但是3-20%的培养中,支原体具有耐药性,3-11%的处理中,显示有细胞毒性。
可以通过使用特殊的试剂(如MycoZap支原体消除试剂)来消除支原体污染。该试剂中含有抗生素和抗代谢药物,可在短时间内消除支原体污染。它经过优化,对细胞伤害小。

如何预防支原体污染?

尽管无法确保实验中100%不含支原体,但可以通过良好的操作规范限制感染机会,同时还可以减少污染传播的风险。减少和预防支原体污染,传播需要三管齐下,确保实验尽量洁净:

正确使用培养试剂和设备

必须确认使用合适的设备,并保证实验室的整洁,这是最重要的。这包括使用经过认证的生物安全柜、定期检查和清洁培养箱,并使用正确处理的耗材和培养材料。

审查和优化细胞培养流程

定期使用可靠的支原体检测方法测试培养物,以消除污染对工作的影响。外来的细胞或组织在确定没有支原体污染前进行隔离,并立即处理掉被污染的培养物。从信誉良好的渠道购买原料。尽量不过度使用抗生素,但对于珍贵的样本,可使用对支原体有效的抗生素(如MycoZap)防止污染。

确保采用可靠的无菌技术

彻底清洗和消毒双手是尽可能洁净培养的关键。穿戴干净的实验室外套和合适的手套也是必要的。其他包括避免用嘴吹、在操作时只作必要的交谈、及时清洁溢出物、使用移液器转移液体和每次只处理一种细胞等。
LONZA支原体解决方案:
支原体检测试剂MycoAlert PLUS
支原体去除试剂MycoZap
支原体预防试剂MycoZap PLUS