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抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)的检测

作者:Admin 日期:2020-09-17 点击:101
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导读

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    基于抗体的治疗方法是治疗疾病的有力工具。尽管该方法的作用机制始终涉及抗体的Fab 区域与特异性靶标相结合,但是通过抗体Fc区域诱导的效应功能也是同样重要的。抗体治疗通过抗体的Fc区域与免疫细胞或补体表面的Fcγ受体(FcγR)相结合而发挥治疗作用,如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性毒性(CDC),两者均可诱导靶细胞死亡,并有助于治疗效果。

    另一种主要的Fc效应功能是抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)。ADCP的机制是抗体作用的靶细胞激活巨噬细胞表面上的FcγR机制,诱导吞噬,使靶细胞内化和被吞噬体酸化降解。ADCP被认为是几种生物制剂的主要作用机制,但是其活性却很难在体外进行检测。本文介绍主要介绍流式检测ADCP活性的方法。

原文标题:A novel method for determining antibody-dependent cellular phagocytosis

作者:Lynn Kamena, et al.

来源:Journal of Immunological Methods, 2019.

部分翻译:土豆胖嘟嘟

前言

    使用靶向抗体激活免疫系统杀死肿瘤细胞一直是一个有效的治疗手段。B淋巴细胞表面的CD20是肿瘤免疫治疗的最初靶标之一。利妥昔单抗是第一个获批的抗CD20的治疗药物,临床数据表明其可激活免疫系统诱导B细胞耗竭。利妥昔单抗的Fc区域与免疫细胞的Fcγ受体相结合,使免疫细胞被激活,通过ADCC路径裂解B细胞。Fcγ受体的参与也可通过ADCP途径内化和裂解靶标细胞。

    与ADCC一样,抗体作用的靶细胞被表达Fcγ受体的免疫细胞所识别。涉及吞噬作用的原发性免疫细胞是巨噬细胞,其表面Fcγ受体的交联作用导致细胞内信号通路被激活,进而引起靶细胞内吞。细胞内的吞噬体沿着高度可调控的成熟路径进行作用,该路径会表达特异性膜蛋白如Rab5和LAMP-1,以及会逐渐酸化吞噬体直到与溶酶体融合最终降解内化细胞。

    FcγR介导的吞噬作用不仅可以应对感染,还可以在肿瘤治疗方面提供重要的治疗功能。巨噬细胞可通过ADCP来内化和吞噬肿瘤细胞。以前的工作表明,一些单克隆抗体,包括靶向肿瘤抗原的抗体,如HER2,Ep-CAM,CD40,CD30和MUC-1,可在体外诱导吞噬作用。因此这种机制被认为是体内抗体介导清除肿瘤细胞的主要作用机制。


实验详情

    1.以人外周血为样本,利用磁珠分选试剂盒进行单核细胞分选。将分选后的单核细胞培养在巨噬细胞分化培养基(RPMI 1640, 10% FBS, 8% human serum, 20mM HEPES, 1% Glutamax, 1% penicillin/streptomycin, and 50 ng/mL M-CSF)中,37 °C,  5% CO2培养5-6天。

    用表1的抗体进行染色,来观察单核细胞和分化后的巨噬细胞Fcγ受体和CD14的表达情况。

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    结果如上图,与单核细胞相比,分化后巨噬细胞的CD14和三种类型的Fcγ受体表达量均有所增加,提高了介导ADCP的潜能。

    2.巨噬细胞用Cell Trace Violet(Thermo Fisher Scientific)染料进行标记;靶标细胞用pHrodo(Thermo Fisher Scientific)进行标记,然后分别重悬于ADCP 实验缓冲液中(RPMI-1640, 10% FBS, 25mM HEPES, 1% Glutamax, 1% penicillin/streptomycin),最后以靶标细胞:效应细胞是2:1的比例进行混匀,37 °C, 5% CO2条件下孵育4.5h,流式分析结果。

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    结果如上所示,被吞噬的细胞包含在细胞囊泡中,囊泡的酸性会逐渐增加。利用吞噬体的PH特性和pHrodo染料的PH敏感性来检测真正被内化的细胞,降低非特异性结合导致的干扰。

    通过流式分析吞噬作用,圈门策略是通过大小和粒度找到活细胞群,然后画门圈定Cell Trace Violet阳性的巨噬细胞,最后分析pHrodo荧光素的强弱来了解吞噬作用。从结论可以看出,通过PH敏感试剂(pHrodo)标记靶标细胞来定量分析细胞吞噬作用的方法是比较可靠的,该方法具有高度可重复性。


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